Pewarnaan Gram merupakan satu teknik makmal bakteriologi[4] yang digunakan untuk membezakan spesies bakteria kepada dua kumpulan besar (gram positif dan gram negatif) berdasarkan ciri-ciri yang ditunjukkan oleh dinding sel.[5][halaman diperlukan] Pewarnaan gram tidak digunakan untuk mengklasifikasi arkea, dulu dikenali sebagai arkeabakteria, kerana organisma tersebut menghasilkan pelbagai respons yang jauh berbeza dan tidak mengikuti kumpulan-kumpulan filogenetiknya.[6]

Pewarnaan Gram ini bukanlah alatan yang sempurna untuk diagnosis, pengecaman, mahupun penentuan filogenik, malahan ianya mempunyai penggunaan yang sangat terhad dalam mikrobiologi persekitaran Ia digunakan secara utamanya untuk membuat pengenalan awal morfologi atau untuk menentukan bahawa terdapatnya sebilangan besar bakteria di dalam spesimen klinikal. Ia tidak dapat mengenal pasti bakteria ke peringkat spesies, dan dalam kebanyakan situasi perubatan, ia tidak boleh digunakan sebagai kaedah tunggal untuk mengidentifikasi bakteria. Di makmal mikrobiologi klinikal, ia digunakan dalam kombinasi dengan teknik-teknik tradisional dan molekul yang lain untuk mengenal pasti bakteria. Sesetengah organisma adalah gram-ubah (bermakna mereka mungkin menyerap warna sama ada negatif atau positif); ada yang tidak berwarna dan tidak kelihatan dengan apa jua pewarna yang digunakan dalam teknik Gram. Dalam makmal mikrobiologi alam sekitar atau makmal molekul moden, kebanyakan identifikasi dilakukan dengan menggunakan turutan genetik dan teknik molekul lain, yang jauh lebih spesifik dan bermaklumat daripada pewarnaan pembezaan.

Pewarnaan Gram telah dicadangkan sebagai alat diagnostik yang efisen setanding dengan PCR dalam sebuah laporan kajian utama berhubungan uretritis gonokokal.[7]Templat:Primary source inline

Mekanisme pewarnaan

Bakteria gram positif mempunyai dinding sel berbentuk jaringan halus yang tebal dan diperbuat daripada peptidoglikan (50–60% daripada lapisan yang membungkus sel), dan hasilnya dinding ini diwarnakan ungu oleh kristal ungu, manakala bakteria gram negatif mempunyai lapisan yang jauh lebih nipis (hanya sebanyak 10% daripada lapisan yang membungkus sel), maka tidak dapat mengekalkan warna ungu sebaliknya diwarnabalik dengan safranin. Terdapat empat langkah asas untuk pewarnaan Gram:

• Mengenakan pewarna pertama (kristal ungu) pada lumuran atau apusan lekat haba bagi suatu kultur bakteria. Fiksasi haba membunuh sebahagian bakteria tapi kebanyakannya digunakan untuk melekatkan bakteria pada slaid supaya bakteria tidak dibasuh keluar sewaktu proses pewarnaan.
• Penambahan iodida, yang mengikat pada kristal ungu dan mengurung kristal ungu dalam sel
• Penyahwarnaan pantas dengan etanol or aseton
• Mewarnabalas kembali dengan safranin.[8] Karbol fuksin kadangkala digantikan dengan safranin kerana ia jauh lebih mudah untuk mewarnakan bakteria anaerob, tetapi jarang digunakan sebagai pewarna balas.[9]

Kristal ungu (CV) berpisah dalam larutan akueus kepada ion-ion CV+ dan klorida (Cl−). Ion-ion ini akan menembusi dinding sel dan membran sel bagi kedua-dua sel gram positif dan gram negatif. Ion CV+ berinteraksi dengan komponen bercas negatif dalam sel bakteria lalu mewarnakan sel kepada ungu.[10]

Ion iodida (I− atau I−
3) akan berinteraksi dengan CV+ dan membentuk kompleks besar kristal ungu dan iodin (CV–I) dalam dan luar lapisan sel. Iodin seringkali merujuk kepada mordan, tetapi merupakan agen perangkap yang mengelakkan penyingkiran kompleks CV–I dan, oleh itu, mewarnakan sel.[11]

Apabila penyahwarna seperti alkohol atau aseton ditambah, ia akan berinteraksi dengan lipid-lipid pada membran sel.[12] Sel bergram negatif akan menghilangkan membran luaran lipopolisakarida, dan lapisan dalaman peptidoglikan didedahkan. Kebanyakan kompleks CV–I telah dibasuh keluar dari sel bergram negatif bersama-sama membran luarannya.[13] Secara jelas perbezaannya, sel bergram negatif dinyahhidratkan selepas pembasuhan dengan etanol. Kompleks besar CV–I terperangkap dalam sel bergram positif disebabkan sifat semulajadi peptidoglikan yang berlapis-lapisan.[14] Langkah penyahwarnaan adalah merupakan langkah yang sangat genting dan mesti dikira masanya dengan tepat; pewarna kristal ungu akan dibuang dari kedua-dua sel bergram positif dan negatif sekiranya agen penyahwarnaan dibiarkan terlampau lama (hanya dalam beberapa saat sahaja).[15]

Selepas penyahwarnaan, sel bergram positif masih kekal warna ungunya manakala sel bergram negatif akan kehilangan warna ungunya. Pewarna balas, yang selalunya safranin atau fuksin asas yang bercas positif, akhir sekali akan dikenakan kepada apusan untuk memberikan bakteria bergram negatif warna merah atau merah jambu.[16][17]